1839年6月20日，发生林维喜事件。林则徐觉得案件可疑，于是命新安县知县梁星源查办，要求义律交出凶手，但义律以领事裁判权为由，要求私自开审凶手。林则徐便委托美国医生伯驾和袁得辉合译瑞士法学家艾默瑞奇·德·瓦特尔的著作《万国公法》，查明义律根本没有治外法权。七月初四（1839年8月12日），义律在英船上开庭，对五名凶手轻判罚金和监禁后，便送回英国监狱服刑，事后才通知中国官方。
林则徐震怒，七月初八（1839年8月15日），下令再次封锁澳门，七月初九（1839年8月17日），勒令义律交出凶手，并勒令澳葡政府将所有英国人驱逐出境。
早在虎门销烟之时，英国商人C·W·金已通知林则徐有英国军舰在广东海域游戈，要林则徐注意，但他最终轻视C·W·金的提醒。但后来的事件，令林则徐意识到战争的可能性，他曾致道光帝，希望拨款买西洋的船炮布设海防，道光帝不肯，结果林则徐只好民间集资，通过新加坡密购英国利物浦铜炮，更购入一艘军舰甘米力治号。
林则徐在鸦片战争中
七月二十（1839年8月30日），英国军舰窝拉疑号抵达广东，义律要求澳门总督边度提供军队协助，却遭边度拒绝。林则徐为维持澳葡政府的中立，于七月廿四（1839年9月1日）巡阅澳门。七月廿七（1839年9月4日）中午，军舰窝拉疑号、路易莎号、珍珠号、剑桥号在香港九龙海域向中国水师开炮，九龙之战爆发，战役历时一个半小时，英军用尽弹药，败走尖沙咀，阵亡者至少十七人。
战败后义律要求重开谈判，声称英国烟商同意不贩鸦片，中方亦可搜检，一查出夹带鸦片，即可没收。已具结者，可自由贸易，不具结者，则在沙角搜检，而不合作的英国烟商限三日内驱逐回国。但林则徐发现了问题，若果不具结者可贸易，禁烟之举必全功尽废，于是林则徐以具结和交凶为必要前提。结果谈判破裂，义律把五名凶手送回英国。
尽管与义律的谈判破裂，但有两艘英国商船汤姆士·葛号和皇家萨克逊号同意具结，林则徐立即允许正常贸易，给予特别保护。义律非常不满，认为有损权威，九月廿八（1839年11月3日）下令军舰窝拉疑号和海阿新号在穿鼻洋武力迫两船折返。提督关天培正常查究期间，窝拉疑号突向中方军队发炮，穿鼻之战爆发。
穿鼻之战战败后，英军尽逃回尖沙咀。林则徐下令军队驻在尖沙咀附近的官涌（今香港九龙油尖旺区佐敦）还击。英军本打算在尖沙咀修理军舰，被中方军队发现，驱逐出海。九月廿九（1839年11月4日）英军还击，欲以大炮轰击官涌军营，但军营地势颇高，中方军队居高临下发炮，英军败退。连续几次交锋后，十月六日（1839年11月11日），林则徐令军队分五路，主动合击英军，凌晨时分，中方军队包抄英军舰队，五路大炮，重叠发击，将英军舰队大半军舰摧毁。十月八日（1839年11月13日），英军舰队又再来犯，林则徐发动总攻击，五路大炮全向军舰船头发炮，英军舰队全灭。九月廿八至十月八日合共九日内，官涌之战六役，林则徐役役皆胜，将英军驱逐尖沙咀。并寻回汤姆士·葛号和皇家萨克逊号两船，带回港口贸易。
战争之后，中英贸易完全断绝，林则徐更密切注意世界局势，他组织一队翻译队伍，专门负责翻译外国报纸和外国书籍。他们翻译了《澳门月报》、英国商务总监戴维斯著的《中国人：中华帝国及其居民的概况》（即《华事夷言》）、传教士地尔洼牧师著的《对华鸦片罪过论》、休·慕瑞著的《世界地理大全》（即《四洲志》），及其他军事书籍。
同时，他亦亲自接触外国人，向虎门销烟时来访的美商C·W·金、传教士裨治文、商船船长弁逊等人询问英国的情况，并接触英国海员，了解英国对禁烟的看法，态度极为亲密。接着他又再写了一封致维多利亚女王的照会，由汤姆士·葛号船主带往伦敦，但英国外交部拒收信件，结果信件刊登在《泰晤士报》上。十二月初一（1840年1月5日），林则徐接任两广总督。
1839年至1840年间，英国出现很多来历不明的小册子，主要控诉封锁十三行事件，并诬指林则徐私自种植罂粟，便排拒外来鸦片，一时之间也引英国民间舆论纷纷。英国国会经过激烈的争论，最终在维多利亚女王的决定性声明下，以271票对262票通过军事行动。
林则徐得知英国军队异动，便加紧改装早前购入的剑桥号，又从旗昌洋行购入参加过九龙之战的甘米力治号，并广泛搜只战船资料，仿制英国军舰，小型欧式双桅纵帆船等。他亦会同关天培亲自校阅水军，重用英国人惧怕的海盗、渔民、蜑户，由外商、盐商、潮商支付用费，治海人民纷纷应征。外商目击并评
“林正忙于训练三千个兵丁，其中三分之一是双刀手。这种双刀有二尺多长，在刀鞘中时看起来很笨重，刀柄略弯如钩以护手，长约二寸。双手持刀，刺击削切，挥刀飞舞，上下左右，同时并呼喊叫骂，面作恶容，以威吓敌人，使其望风而逃。林对于这些人，具有很大信心。”
其后，林则徐发动了长沙湾之战，将藏在长沙湾的英国军舰驱离。怡和洋行的马地臣又偷偷贩卖鸦片，林则徐便派人攻击烟商船队，是为磨刀洋之战。
英国政府任命义律的堂兄乔治·懿律和全权代表，派遣的远征军于五月廿三（1840年6月22日）正式集合，总共有军舰十六艘、武装轮船四艘、运兵舰一艘、运输舰二十七艘。士兵四千人，包括第18皇家爱尔兰联队、第26苏格兰来福枪联队、第49孟加拉联队、孟加拉工兵团和马德拉斯工兵团等。远征军一抵达，即宣读英国政府的命令，封锁广州海岸，并打算攻打虎门示威。但林则徐早有准备，于澳门、虎门、尖沙咀及内河要道设重兵驻守，加上广州海岸多浅水暗礁的天然屏障，英军无隙而入。同时，林则徐向广东民众颁布《英夷鸱张安民告示》，鼓厉人民杀敌，杀一白人士兵赏洋银百元，杀一南亚士兵赏洋银五十元。英军并无攻打广州之意，只留下军舰都鲁壹号、拉呢号、海阿新号及武装轮船进取号继续封锁广州海岸，其他军舰北上闽境。林则徐的防守是多此一举。
虎门硝烟
六月初四（1840年7月2日）早晨，军舰布朗底号带着《巴麦尊致中国宰相书》副本前往厦门，要求上岸，但遭拒后向岸边发炮，最后由厦门守军击退。次日，林则徐向江苏、浙江二省通知英军入侵的消息，但两省大吏认为林则徐的话不足信，完全未做丝毫抗敌准备。结果伯麦率领的军队于六月初七（1840年7月5日）轻易占领舟山定海县，掠财屠城。
中国沿海的总督巡抚，没一个像林则徐具有如此的前瞻眼光，当英军占领定海的消息传来，林则徐气愤痛骂浙江巡抚乌尔恭额。他向道光帝奏收复定海的方法，但道光帝已经对林则徐转变态度，对之不予理采。
封锁广州海岸的英军开始在珠江口横行无忌，英国军人温森特·士担顿枪杀船舵工盛全福，澳门民众活捉了士担顿。留在广州海岸的两名英军军官士密和参逊要求林则徐放人，林则徐拒绝。为防英军入侵澳门，林则徐和关天培增兵二千人入澳门，调集军舰防守。七月廿二（1840年8月19日）下午二时，英军由九州洋驶至关闸、拱北一带，向中国守军发炮，清军反击，英军败退，这次是为关闸之战。八月初五（1840年8月31日），林则徐派军舰于穿鼻洋和南龙穴一带的矾石洋向英军反击，是为矾石洋之战，英军反应不及，大败。清军只有数名轻伤者，而英军死伤惨重，英军点算至少十五士兵阵亡。第一次鸦片战争之中，唯有林则徐领导的七次战役取得胜利，英军对广州海岸的进攻失败。
七月十四（1840年8月11日），英军主力驶到天津大沽口外，要求清廷接收《巴麦尊子爵致中国皇帝钦命宰相书》（简称《巴麦尊照会》），时任直隶总督的琦善收到林则徐的英军入侵通知，但并未理会，认为他们单纯为通商而来。到英军来临，依然不对战，并馈赐牛羊及礼品。
其后，琦善伙同穆彰阿、伊里布等一向与林则徐有过节的朝臣向道光帝夸大英军军力，诬指林则徐允许烟片贩卖后又反悔禁烟，激起英国发动战争，将所有战争责任归咎林则徐身上。另外，《巴麦尊照会》中，英国政府限令清廷十日内善妥照会内的要求，否则就封港口、截船只、占岛地。
道光帝对林则徐愤怒交加，在奏折中谴斥林则徐：
“外而断绝通商，并未断绝；内而查拿犯法，亦不能净，无非空言搪塞，不但终无实济，反生出许多波澜，思之曷胜愤懑！看汝以何词对朕也！”
道光帝命琦善向英方交涉，并当钦差大臣往广东查办，琦善对英方的要求处以闪避态度，只想革职林则徐了事。英方不许，派军驶往山海关一带示威，道光帝命清军不得反抗，露出妥协之意。最后，琦善只同意对林则徐革职查办，而英军考虑补给等因素，亦退兵南下，道光帝对琦善表示嘉赏。
林则徐被革职
八月廿九（1840年9月24日），林则徐回复道光帝的硃批，对指斥加以抗辩，在上折的《密陈办理禁烟不能歇手片》中指出，鸦片之流入已经证明外商包藏祸心，战争是意料中事，若不一次过扫清外国势力，他国亦会仿效英国，必祸患无穷。并表示自己建的船炮是必须之物，只要增强国防力量，才能对抗船坚炮利的入侵者，建议用关税的十分之一来制造炮船。但他亦知事情已无法挽回，唯有奏请治罪，请去浙江前线将功折罪。然而，林则徐得到道光帝对其抗辩之答复是：
“汝云英夷试其恫吓，是汝亦欲效英夷恫吓于朕也！无理！可恶！…………一片胡言！”
结果，林则徐被革去两广总督一职，由怡良署任，直到新任两广总督琦善到来。另外支持林则徐的邓廷桢亦被革职。林则徐的去职消息引起中外轰动，西报连连发表社论讨论事件，甚至乎英方亦表示：
“全部（禁烟）方针是像水晶一样明晰…………林公自是中国的好总督，有血性，有才气…………我国…………不得不全力以争通商，岂为仇林总督而来耶！”
林则徐就此羁滞广东，署理两广总督怡良一向是林则徐的支持者，署理期间亦不忘禁烟，广建武装。但道光帝勒令怡良撤兵，怡良久久不能动手，他向林则徐征询意见，林则徐示意他向道光帝奏报撤二千的少数兵力，令道光帝不疑有他，保存广东兵力。
毕竟怡良只是署理两广总督，在位短短三十五日后，琦善到任，他一来就把原先林则徐推行的政策完全废除，把林则徐引入的新式武器废置，解散水师，结果大角炮台、沙角炮台失陷。林则徐抛下对琦善的恩怨，出手相助。但琦善只想将一切过失都推向林则徐处，不肯让他插手立功。林则徐忍无可忍，要求怡良架空琦善，以巡抚身份来布防和动员民众。但怡良还未行动，琦善于十二月廿八（1841年1月20日）与义律拟订《穿鼻草约》，草约的其中一项条款就是割让香港岛给英国。
道光帝得知英军继续进攻沿海，而且不肯离开定海，态度渐转强硬，于是复命林则徐及邓廷桢“协理夷务”，琦善礼节性拜会林则徐，希望他转向主和的态度，林则徐反应冷淡。
琦善对于割让香港岛给英国一事保持隐瞒，但义律、马礼逊、伯麦等人也不等草约签定，就宣布占领香港。赖恩爵告之怡良香港岛割让的消息后非常震惊，怡良也向林则徐告示这消息。林则徐认为怡良向道光帝弹劾琦善，才能保住香港岛。但怡良怕无证据之下弹劾，会被琦善反咬一口，最后在林则徐敦劝和具体协助下，下定决心上奏，奏折亦在林则徐修改润色后呈上道光帝。然而，文件未来得及呈上道光帝，琦善打算于道光二十年正月十八（1841年2月9日）正式签订《穿鼻草约》，此时，广东士绅常琦善之行动震怒，声讨琦善，广东的高级官员又站在怡良一边，琦善不敢签约。
林则徐知广东士气涣散，自己仍可“协理夷务”之际增强广东防务，局面改观，于是郑重建议琦善抓住战机，迎击敌军、公布道光帝上谕、招抚汉奸、组织民众对抗，但林则徐所有提议皆被琦善一一否决。二月初五（1841年2月25日），英军进攻虎门，关天培、麦廷章亲自督军，但由于士气涣散，靖远炮台、镇远炮台、威远炮台失陷。林则徐和邓廷桢急求琦善出兵救援，可惜援兵来得太迟。横挡炮台、永安炮台、巩固炮台亦告失陷，关天培、麦廷章以身殉国。
是以，英军北攻广州，二月初七（1841年2月27日），英军经乌涌。林则徐本来在那里设有乌涌炮台，打算作虎门炮台之后的第二重防线，他购入的甘米力治号改装的截杀号亦在乌涌看守。不过英军一攻，清军先乱，截杀号没有发挥任何作用就被击沉。二月初九（1841年3月1日），潖州炮台失陷，二月初十，猎得炮台失陷。
琦善无可奈何，答应义律的条款。但道光帝从怡良得知香港岛被琦善私自割让，下令将琦善革职锁拿，押京治罪，家产查抄入官。改派湖南提督杨芳主持军事。但杨芳竟是昏庸无能之人，道光帝最后将杨芳连带怡良一同革职。英国方面，英国外相亨利·约翰·坦普尔不满义律在《穿鼻草约》中得益太少，撤销义律职务，改派亨利·璞鼎查（又译砵甸乍）担任新的商务总监。闰三月十一（1841年5月1日），道光帝命林则徐以四品卿调任浙江。